生(shēng)化培(péi)養(yǎng)箱(xiāng)在多(duō)管發(fā)酵法的應(yīng)用(yòng)分析
更(gēng)新更新時間(jiān)：2013-06-19 點擊次(cì)數(shù)：3353
1.多(duō)管發(fā)酵法(fǎ)
初(chū)發酵實(shí)驗(yàn) 發酵管內裝有(yǒu)單(dān)倍或(huò)三(sān)倍(bèi)乳(rǔ)糖蛋白腖(dòng)培養液，並在內(nèi)倒(dǎo)置有小玻(bō)璃(lí)管。每(měi)個(gè)樣品用三(sān)個不(bù)同(tóng)的水樣(yàng)量接種(zhǒng)，同一接(jiē)種水樣量(liáng)要(yào)有(yǒu)五管(guǎn)，將(jiāng)水樣(yàng)分別(bié)接(jiē)種到裝有乳糖(táng)蛋白(bái)腖(dòng)培養(yǎng)液的發酵管中(zhōng)，在37℃±0.5℃下(xià)培(péi)養(yǎng)24h±2h。乳(rǔ)糖能起(qǐ)選擇(zé)作用(yòng)，因為(wéi)很多(duō)細菌不能發酵乳(rǔ)糖(táng)，而大腸菌(jūn)群能發酵(jiào)乳糖(táng)並產酸產(chǎn)氣(qì)。培(péi)養液(yè)中加(jiā)入溴甲酚(fēn)紫作(zuò)為酸(suān)度指(zhǐ)示劑，細菌產(chǎn)酸後，培養液(yè)即(jí)由原來的紫色變成(chéng)黃色。產酸產氣的發酵管(guǎn)表(biǎo)明試(shì)驗陽(yáng)性，如在(zài)倒管內(nèi)產氣不(bù)明顯(xiǎn)，可輕拍(pāi)發(fā)酵管，有(yǒu)小氣泡升(shēng)起(qǐ)為(wéi)陽(yáng)性(xìng)。
復(fù)發酵實(shí)驗 輕微振(zhèn)蕩初(chū)發(fā)酵試(shì)驗(yàn)陽性結果的發酵(jiào)管(guǎn)，用(yòng)3mm接(jiē)種環將培養(yǎng)物（2-3環）轉接到EC培養液(yè)中，在(zài)44.5℃±0.5℃下培養(yǎng)24h±2h（提(tí)高(gāo)培(péi)養(yǎng)溫度可造(zào)成不利(lì)於來自(zì)自然環境(jìng)的大腸菌群的生長）。培養後立(lì)即觀(guān)察，發(fā)酵(jiào)管(guǎn)產氣(qì)則(zé)證(zhèng)實為糞(fèn)大腸菌群(qún)陽性。
2.濾(lǜ)膜法
濾膜是(shì)一種微(wēi)孔性濾膜，孔徑(jìng)0.45μm。將水(shuǐ)樣(yàng)注(zhù)入(rù)已滅(miè)菌的(dí)放有(yǒu)濾(lǜ)膜的過濾(lǜ)器中，經(jīng)過抽(chōu)濾，細(xì)菌(jūn)即被截留(liú)在(zài)膜上，然(rán)後(hòu)將濾膜(mó)貼於(yú)M-FC培(péi)養(yǎng)基(jī)上，在(zài)44.5℃±0.5℃下培(péi)養24 h±2h。糞大(dà)腸(cháng)菌(jūn)群菌落(là)在(zài)M-FC培養基(jī)上呈藍色或(huò)藍(lán)綠色，其他非(fēi)糞大腸(cháng)菌群菌落(là)成灰色，淡黃(huáng)色(sè)或無色(sè)。正(zhèng)常(cháng)情(qíng)況下(xià)，由(yóu)於溫(wēn)度和玫瑰酸鹽(yán)試劑(jì)的(dí)選擇(zé)性(xìng)作用(yòng)，在M-FC培(péi)養(yǎng)基(jī)上(shàng)很(hěn)少見到非糞(fèn)大(dà)腸菌菌(jūn)落(là)。
二(èr).兩種(zhǒng)方法(fǎ)的注(zhù)意(yì)事項
1.培(péi)養溫(wēn)度(dù)的要求 總大(dà)腸菌(jūn)群(qún)中的(dí)細菌除(chú)生活在(zài)腸道(dào)中外(wài)，在(zài)自(zì)然環境中的(dí)水(shuǐ)與(yǔ)土(tǔ)壤中(zhōng)也經常存(cún)在，但此(cǐ)等(děng)在自然環境中(zhōng)生活的大(dà)腸菌(jūn)群(qún)培(péi)養(yǎng)的zui合適溫度為25℃左右，如(rú)在37℃培(péi)養則仍(réng)可生長，但(dàn)如將培(péi)養(yǎng)溫(wēn)度(dù)再升高至44.5℃，則不(bù)再生(shēng)長，而(ér)直接來(lái)自糞(fèn)便(biàn)的大腸菌群(qún)細(xì)菌，習慣(guàn)於37℃左右生(shēng)長(cháng)，如(rú)將培養溫(wēn)度(dù)升高至44.5℃仍可(kě)繼續(xù)生長。因(yīn)此，可(kě)用(yòng)提高(gāo)培(péi)養(yǎng)溫(wēn)度(dù)的方(fāng)法將自(zì)然(rán)環(huán)境中的大腸菌群與糞(fèn)便(biàn)中的大(dà)腸(cháng)菌(jūn)群(qún)區分(fēn)，兩種(zhǒng)方(fāng)法(fǎ)也都(dū)基於此理。將接(jiē)種好的樣(yàng)品或(huò)裝(zhuāng)有濾膜(mó)的培(péi)養基(jī)放入(rù) 生化(huà)培養箱(xiāng) 時，箱(xiāng)內(nèi)溫度(dù)一(yī)定(dìng)要(yào)達(dá)到所要求的溫度（44.5±0.5℃）時，方(fāng)可放入。如(rú)用恒溫(wēn)水(shuǐ)浴箱(xiāng)時，其(qí)水麵要高於接種(zhǒng)物麵(miàn)，放濾(lǜ)膜的(dí)培養皿(mǐn)要沉到水(shuǐ)浴箱(xiāng)底(dǐ)部。
2.加氯水(shuǐ)樣的(dí)處(chǔ)理 經氯處理消毒(dú)過的(dí)水樣，水中含(hán)有(yǒu)一定量的(dí)餘氯，使(shǐ)大腸菌群(qún)處(chǔ)於受損或(huò)受抑製狀(zhuàng)態(tài)，在(zài)采(cǎi)集水(shuǐ)樣時應提前(qián)在采樣瓶中加硫代(dài)*，硫代*可以脫氯，使(shǐ)受(shòu)損的(dí)細(xì)菌(jūn)得以復(fù)蘇(sū)與修復，從(cóng)而避(bì)免出(chū)現計(jì)數(shù)結果(guǒ)偏低甚至假陰性的(dí)現象(xiàng)。此(cǐ)外(wài)餘氯(lǜ)對(duì)濾膜法培養(yǎng)的細菌其抑製(zhì)作(zuò)用(yòng)尤(yóu)為明(míng)顯，所以抽濾時應對水樣進(jìn)行(háng)大量(liáng)無(wú)菌(jūn)水稀(xī)釋(shì)，以(yǐ)減少餘(yú)氯的殘留(liú)。
3.樣品的保存(cún) 采(cǎi)樣用(yòng)的容(róng)器(qì)使(shǐ)用(yòng)前(qián)應(yīng)蓋(gài)好(hǎo)瓶蓋(gài)，用牛皮(pí)紙將(jiāng)瓶(píng)蓋和(hé)瓶頸處包(bāo)裹(guǒ)好，置幹燥箱(xiāng)160℃-170℃幹熱(rè)滅菌2h，或(huò)用高壓蒸汽(qì)滅菌器(qì)121℃滅菌15min。采樣後水(shuǐ)樣(yàng)的正(zhèng)確保(bǎo)存(cún)也很重(zhòng)要，如(rú)保存(cún)不當(dāng)可使樣(yàng)品中的(dí)大(dà)腸菌群細(xì)菌死亡(wáng)或在(zài)一定條件(jiàn)下(xià)再生長，這些(xiē)都(dū)將影響檢(jiǎn)測結果(guǒ)的準確性。檢測(cè)室接到水樣後(hòu)，應立即檢測(cè)，如因(yīn)故不能檢測時，應立即(jí)將樣(yàng)品(pǐn)置於(yú)冰箱(xiāng)內（2℃-10℃）並於2小時內檢(jiǎn)測。
4.培養物(wù)質的製備與(yǔ)保存
⑴.多管(guǎn)發(fā)酵(jiào)法所(suǒ)使用(yòng)的培(péi)養(yǎng)液在分(fēn)裝(zhuāng)於(yú)各發(fā)酵管中(zhōng)後(hòu)，應將(jiāng)發(fā)酵管(guǎn)盡快放(fàng)於高(gāo)壓(yā)蒸汽滅菌器(qì)中，在(zài)115℃滅菌(jūn)20min（注意(yì)：這(zhè)個溫(wēn)度也應(yīng)控(kòng)製(zhì)好，既達(dá)到(dào)滅菌的(dí)作用(yòng)，還要防止(zhǐ)培養物(wù)質(zhì)分(fēn)解(jiě)流失），然(rán)後(hòu)貯存於冰箱或(huò)暗處(chǔ)備用。
⑵.濾膜法所(suǒ)采用(yòng)的M-FC培養(yǎng)基多(duō)使用外購(gòu)的成品(pǐn)，培養(yǎng)基中(zhōng)苯胺(àn)藍的純度和(hé)質量(liáng)往往影響菌落的(dí)顏(yán)色(sè)，因此(cǐ)，無(wú)菌包裝(zhuāng)的成套培養基在使用前(qián)，先接(jiē)種(zhǒng)典型糞大(dà)腸(cháng)菌，以觀(guān)察對(duì)比(bǐ)菌落(là)的(dí)顏(yán)色(sè)，來鑒定(dìng)其穩定性(xìng)。
5.結果(guǒ)統(tǒng)計(jì)
⑴.多管發酵(jiào)法(fǎ)的結果是根(gēn)據(jù)不同(tóng)接種(zhǒng)量的發(fā)酵管(guǎn)所出現陽性(xìng)結果(guǒ)的數目，從(cóng)MPN表中(zhōng)查(chá)得相(xiāng)應(yīng)的MPN指(zhǐ)數，來計(jì)算每升水中糞(fèn)大腸(cháng)菌群細菌的(dí)MPN值。MPN是(shì)“Most Probable Number”的縮寫(xiě)，指zui大可(kě)能數，它(tā)是根(gēn)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)理論，估計水體(tǐ)中(zhōng)的菌群密度和衛生質(zhì)量(liáng)的一種方(fāng)法(fǎ)，所以(yǐ)準(zhǔn)確判(pàn)斷不同(tóng)接種量(liáng)發酵(jiào)管的(dí)陽性數是非(fēi)常重要的，否則將(jiāng)導(dǎo)致(zhì)較大(dà)偏差。
⑵.濾膜(mó)法的結果是計數濾膜上(shàng)呈藍(lán)或藍綠色的菌(jūn)落(là)，來(lái)計算出每升水樣中的糞大(dà)腸菌(jūn)群(qún)數。所以(yǐ)為(wéi)便於計(jì)數，減少(shǎo)誤差，理(lǐ)想(xiǎng)的水(shuǐ)樣體(tǐ)積(jī)是(shì)一(yī)片濾膜上(shàng)生長(cháng)20-60個(gè)糞(fèn)大(dà)腸(cháng)菌群菌落(là)。
三.在(zài)實際(jì)中(zhōng)的(dí)應(yīng)用探(tàn)討
1.檢(jiǎn)測方法對樣品(pǐn)的適用性(xìng)
⑴.多(duō)管發酵(jiào)法(fǎ)由於(yú)隻(zhī)需(xū)要根據水(shuǐ)樣的取(qǔ)樣量來(lái)決(jué)定(dìng)將(jiāng)樣品(pǐn)培(péi)養於何種培養(yǎng)液中（單(dān)倍或是三倍乳(rǔ)糖）進行培(péi)養(yǎng)，因(yīn)此理論上可適(shì)用於各種水樣(yàng)，但由於(yú)受發(fā)酵管容積(jī)的限製(zhì)，其更適合檢測水源水(shuǐ)，地(dì)表(biǎo)水(shuǐ)和汙(wū)染源(yuán)廢(fèi)水（取樣量不大(dà)），而且(qiě)如果(guǒ)接(jiē)種的(dí)水樣量不(bù)是MPN表(biǎo)中的三種接(jiē)種量時，還(huán)需用(yòng)公(gōng)式(shì)進行換(huàn)算。
⑵.濾(lǜ)膜法主(zhǔ)要是采(cǎi)用抽濾裝(zhuāng)置(zhì)將(jiāng)細菌(jūn)截(jié)留(liú)在濾膜(mó)上(shàng)，然後(hòu)將(jiāng)濾(lǜ)膜貼附在固(gù)體培(péi)養基(jī)上培(péi)養，因(yīn)此可用(yòng)於檢測體積(jī)較大的水(shuǐ)樣(yàng)，但(dàn)受(shòu)濾(lǜ)膜孔徑的限製(zhì)，在(zài)檢測混濁度高（汙染(rǎn)源(yuán)廢(fèi)水），非(fēi)大(dà)腸杆菌(jūn)類細菌(jūn)密(mì)度大(dà)（河湖(hú)水）的水樣時(shí)，對(duì)菌(jūn)落計數統計有(yǒu)一定(dìng)影響，此(cǐ)外，如水(shuǐ)樣中有毒(dú)性(xìng)物質較(jiào)高，也(yě)會(huì)在(zài)濾膜上形(xíng)成累積，抑製細菌培養(yǎng)。
2.檢測時間及操(cāo)作(zuò)過程(chéng)的繁(fán)瑣度
⑴.多(duō)管(guǎn)發酵法需要經過(guò)初發(fā)酵(jiào)試(shì)驗(yàn)和(hé)復發(fā)酵(jiào)試驗(yàn)兩個過程後才能(néng)根據(jù)不同接(jiē)種量的(dí)發酵管(guǎn)所(suǒ)出現陽性結(jié)果的數(shù)目，從(cóng)MPN表中(zhōng)查得相(xiāng)應的MPN指(zhǐ)數，從而(ér)zui後得(dé)出(chū)每升(shēng)水(shuǐ)中糞大(dà)腸菌群(qún)細菌的(dí)MPN值。可(kě)以看(kàn)出，多管(guǎn)發酵(jiào)法的(dí)培養時(shí)間至少需要2天(tiān)以(yǐ)上(shàng)，且對接(jiē)種量，每(měi)一接種量的(dí)發(fā)酵管(guǎn)數(shù)都(dū)有嚴格要求(qiú)（MPN表(biǎo)多采用(yòng)9管(guǎn)，15管(guǎn)發(fā)酵管，接(jiē)種(zhǒng)量為(wéi)10ml，1ml，0.1ml3種體積查詢），否(fǒu)則(zé)結果難(nán)以統計(jì)。
⑵.濾膜法目(mù)前主要(yào)采用成套(tào)NPS（濾膜(mó)+培養(yǎng)基+培養皿）進行(háng)細(xì)菌截留(liú)和培(péi)養，操(cāo)作簡(jiǎn)單，使(shǐ)用(yòng)時(shí)隻(zhī)需(xū)用少量無(wú)菌水(shuǐ)潤(rùn)濕培養(yǎng)基墊(diàn)即可(kě)使(shǐ)用(yòng)，培(péi)養(yǎng)時(shí)間1天左右，能比(bǐ)多管發酵法更快(kuài)地獲(huò)得結(jié)果(guǒ)，還具有(yǒu)高度的再(zài)現性和精密性(xìng)。此外由於采用(yòng)單片無菌包(bāo)裝(zhuāng)，節省了(liǎo)滅菌時間(jiān)，還(huán)避(bì)免操作(zuò)過程(chéng)中的二次汙染，並(bìng)且(qiě)長(cháng)有菌落(là)的濾(lǜ)膜(mó)片可(kě)在紫(zǐ)外綫滅菌(jūn)，幹燥後(hòu)作為(wéi)檢測記(jì)錄*保(bǎo)存，更(gēng)符合計(jì)量認證(zhèng)規範。
3.檢測成本(běn)的考(kǎo)慮
⑴.多(duō)管發(fā)酵法(fǎ)所用的發酵(jiào)管(guǎn)，小玻(bō)璃倒管和(hé)塑料蓋可在(zài)清(qīng)洗，高壓滅菌和紫(zǐ)外(wài)綫消(xiāo)毒後重(zhòng)復(fù)使用(yòng)，液(yè)態培養基可(kě)自行配製(zhì)或采(cǎi)用市售已配(pèi)好的(dí)綜合培養基，檢測(cè)的成(chéng)本(běn)不高。由於其方法較(jiào)繁(fán)瑣(suǒ)，目(mù)前(qián)正(zhèng)有一種經(jīng)過US EPA認證(zhèng)的水和廢水中(zhōng)糞大(dà)腸菌群檢測(cè)的(dí)標準(zhǔn)方法(fǎ)逐步取代(dài)它，這種(zhǒng)在美國(guó)，日本和加拿(ná)大(dà)等(děng)國(guó)家廣泛使用的檢測(cè)技(jì)術(shù)在國(guó)內也有(yǒu)一定使用(yòng)（北(běi)京市環境檢測中心，北京市排水集團檢測中心(xīn)等），這種方法就(jiù)是使用IDEXX colilert試(shì)劑來(lái)檢測水(shuǐ)中(zhōng)糞大腸菌(jūn)，雖(suī)然它(tā)是(shì)基於多管發酵法原理，不過(guò)卻將(jiāng)其操(cāo)作大(dà)大簡(jiǎn)化了。當(dāng)然，伴隨著(zhuó)操(cāo)作的(dí)簡化(huà)，檢測成(chéng)本(běn)也(yě)大幅提高(gāo)，設(shè)備基本上全是進(jìn)口的，前期(qī)投入大概在(zài)8萬元(yuán)至(zhì)10萬元(yuán)人民(mín)幣之(zhī)間，且由(yóu)於采樣(yàng)瓶，試(shì)劑和(hé)密(mì)封計(jì)數(shù)盤(pán)都(dū)是(shì)一次性(xìng)使用(yòng)，單個樣品的檢(jiǎn)測(cè)成本(běn)也將(jiāng)達到200元(yuán)人民幣左右。
⑵.濾(lǜ)膜(mó)法主要采用的(dí)抽濾裝置(zhì)（拋(pāo)光不(bù)鏽鋼3歧管過濾(lǜ)器，500ml漏(lòu)鬥，無油隔膜真(zhēn)空正壓兩用泵和(hé)手動無菌水加液器(qì)）也基本上來自於(yú)進(jìn)口，目(mù)前很多單(dān)位(wèi)使(shǐ)用(yòng)的都是德國賽多(duō)利斯公司(sī)生產的產品(pǐn)，其前(qián)期投(tóu)入大(dà)概在2萬(wàn)元(yuán)至3萬(wàn)元(yuán)人(rén)民幣左右(yòu)（包(bāo)括(kuò)100套無(wú)菌包裝的(dí)NPS，12元(yuán)/每套(tào)）。由(yóu)於(yú)每個(gè)樣品需采用(yòng)3種不(bù)同的稀釋(shì)比進行過濾培養(yǎng)，要使(shǐ)用3套NPS，所(suǒ)以單個樣品(pǐn)的(dí)檢測成本(běn)在50元(yuán)人民幣(bì)左(zuǒ)右。
四(sì).建(jiàn)議
從(cóng)兩(liǎng)者在(zài)幾(jī)個方(fāng)麵(miàn)的比(bǐ)較可以(yǐ)看(kàn)出(chū)，濾膜法(fǎ)具有(yǒu)省時(shí)，省(shěng)料(liào)，設備要求(qiú)低以及可以(yǐ)采集較(jiào)多的(dí)檢測水(shuǐ)樣等優點(diǎn)，而且隨(suí)著應急檢測機製的(dí)建(jiàn)立，當(dāng)需要我們對(duì)各種(zhǒng)突(tū)發環境汙(wū)染(rǎn)事(shì)件（醫(yī)院廢水(shuǐ)是否加氯處(chǔ)理，河湖(hú)是否(fǒu)受(shòu)生活廢水(shuǐ)汙染）迅速做出反應(yīng)，更快地獲得(dé)肯定結(jié)果(guǒ)的(dí)時候，其(qí)優點越發(fā)突出。
因(yīn)此在實際檢測工作(zuò)中，我(wǒ)們(mén)可以將濾膜法(fǎ)作為主要檢測方(fāng)法，並采取措施(shī)克(kè)服(fú)其易受水樣(yàng)混濁(zhuó)度(dù)，其它菌種(zhǒng)和有毒物質(zhì)幹(gān)擾的局(jú)限性，快(kuài)速反(fǎn)映(yìng)水質情況，為監(jiān)督(dū)管理(lǐ)部門(mén)提(tí)供科(kē)學數據;將多(duō)管發酵法作為輔助方(fāng)法(fǎ)，通(tōng)過其來(lái)對(duì)濾膜法培養的(dí)可疑菌種進行鑒定(dìng)，從(cóng)而(ér)使(shǐ)檢(jiǎn)測(cè)結(jié)果(guǒ)更加準(zhǔn)確(què)，隻有這(zhè)樣，水中的(dí)細菌(jūn)學檢測(cè)才能順(shùn)利(lì)，的開(kāi)展(zhǎn)。
